“A versão da biotecnologia da máquina Xerox” – é o que a revista Forbes chamou de reacção em cadeia da polimerase (PCR). Essa técnica revolucionária permite que um cientista colecte uma amostra contendo uma quantidade mínima de DNA e replique essa sequência de DNA até que haja um milhão de cópias em vez de apenas uma ou duas.

Kary Mullis, inventor da PCR, ganhou um prêmio Nobel em 1993 por ter descoberto esta invenção multimilionária, que se tornou indispensável para qualquer laboratório de genética. É irônico que uma das primeiras aplicações da PCR tenha sido para detectar o HIV, considerando que o próprio Mullis não acredita que sua invenção seja capaz disso. Mullis afirma que o problema é que a PCR é muito eficiente – ela amplifica qualquer DNA que esteja na amostra, independentemente de esse DNA pertencer ao HIV ou a um contaminante. E como você decide qual parte do material amplificado pode ser HIV e qual parte do(s) contaminante(s), se você não conseguiu detectar o HIV na amostra sem usar PCR?

Um dos principais argumentos contra a hipótese do HIV/AIDS é que, ao se empregar métodos tradicionais de detecção do vírus, o HIV nunca foi inferido em quantidades significativas em pessoas com AIDS. Quando a cultura do vírus é empregada para detectar o HIV, o HIV nunca é visto ou mesmo procurado nas culturas. Sua presença é medida por métodos muito indirectos: ensaios para detecção de transcriptase reversa ou uma proteína p24, nenhum dos quais é específico para o HIV. Os métodos indirectos não seriam necessários se uma quantidade significativa de HIV estivesse lá para começar.

Em outras palavras, se uma quantidade significativa de HIV estivesse presente, as técnicas laboratoriais consagradas pelo tempo deveriam ser capazes de encontrá-lo. Eles não podem. Agora precisamos não apenas da PCR, mas de modificações e melhorias contínuas na PCR, para tentar encontrar o HIV. Foi assim que surgiu a ideia de “carga viral”, inspirada por duas enxurradas de artigos científicos que afirmavam que o HIV está se replicando activamente aos biliões: inicialmente, artigos argumentam que o HIV estava “escondido nos gânglios linfáticos”1,2 e, mais recentemente, , os artigos de Ho e Wei.3,4 Os últimos estudos tentaram medir a “carga viral” em um determinado ponto, após o qual drogas “antivirais” foram administradas ao paciente. As drogas deveriam prevenir a replicação de qualquer novo HIV, e a carga viral diminuiria de acordo. No entanto, em poucos dias, o vírus restante sofreria mutação para uma forma resistente às drogas e, em poucas semanas, a carga viral retornaria aos níveis pré-tratamento. Aplicando uma fórmula matemática a essa dinâmica, a taxa de replicação do vírus foi supostamente determinada.

Daí nasceu o que chamo de “Dr. A teoria do lavatório da cozinha de Ho”. De acordo com Ho, biliões de cópias do HIV estão sendo feitas todos os dias, que infectam bilhões de células T4. Essas células T são destruídas não pelo HIV, mas pelo sistema imunológico. Eles são reabastecidos todos os dias, mas com o passar dos anos, o sistema imunológico perde terreno e o HIV finalmente vence. Esse processo foi comparado a um lavatório com o ralo aberto, a água entra de uma torneira (novas células T sendo feitas) a uma taxa ligeiramente menor do que drenada (células T infectadas sendo destruídas).

É muito importante notar que todos os estudos de carga viral dependem completamente de PCR e técnicas relacionadas. Este artigo irá desacreditar a PCR como um método preciso para determinar a infecção pelo HIV, o que, por sua vez, lançará dúvidas sobre quaisquer conclusões sobre o HIV que tenham sido feitas com base nas técnicas de PCR.


Como funciona o PCR
A teoria do HIV diz que, como outros retrovírus sugeridos, contém RNA, mas não DNA: quando se diz que o HIV infecta uma célula, acredita-se que a enzima transcriptase reversa transforma o RNA em DNA complementar, que é então inserido no DNA da célula hospedeira. . Portanto, se a PCR for usada para analisar o tecido humano quanto à presença de HIV, ela estará procurando apenas um pequeno segmento de toda a fita de DNA celular. Esse pequeno segmento representa o material genético proposto para o HIV, que teoricamente foi incorporado ao DNA da célula. (Estudos de carga viral tentam procurar HIV livre de células. Mesmo aqui, a PCR está procurando apenas parte de todo o pacote genético proposto do HlV, ou genoma, não um vírus inteiro.)

Obviamente, é necessário que os primers sejam específicos para o HIV. Se a PCR produzirá um produto amplificado (um “PCR positivo”) depende se os primers adicionados correspondem a parte do DNA na amostra alvo.
Abaixo, veremos que a especificidade dos primers para o HIV está em dúvida. Mesmo que os primers fossem específicos para o HIV, se sequências semelhantes estiverem presentes no alvo, os primers, sob condições frouxas, formarão híbridos com (ou se ligarão) a sequências relacionadas que são menos do que uma combinação perfeita.
Eles irão então preparar a polimerase, que inicia o procedimento de amplificação, mesmo que nenhum HIV estivesse presente para começar.


USANDO PCR PARA ENCONTRAR HIV
Um problema para a hipótese do HIV era que, mesmo com o uso de PCR padrão, os pesquisadores não conseguiam encontrar muito HIV em pessoas com diagnóstico de AIDS. Para resolver esse paradoxo, os autores dos novos artigos sobre “carga viral” criaram duas modificações da PCR, que alegaram ser muito mais eficientes em encontrar o HIV.
Estes foram o QCPCR e o teste de DNA ramificado (bDNA). E de repente – eureka! – foram encontrados bilhões de cópias do que se acreditava ser HIV. A contradição aqui parece ter escapado aos autores desses artigos: por que novos testes tão poderosos seriam necessários para encontrar um micróbio que está presente na casa dos bilhões? Os métodos tradicionais devem ser suficientes.


QC-PCR
Este é o teste usado nos artigos acima mencionados por Anthony Fauci (Pantaleo) e Ashley Haase (Embretson), que afirmavam que o HIV estava “escondido nos linfonodos”. Esses trabalhos foram aceitos como facto, embora a QC-PCR tenha sido e continue sendo uma técnica não validada.

Mark Craddock, da Universidade de Sydney (Austrália), explicou os princípios e os problemas da QC-PCR da seguinte forma:8
“A PCR em massa produz fragmentos de DNA. Você começa com uma pequena quantidade de DNA e após cada ciclo de PCR, a quantidade de DNA que você tem é entre uma e duas vezes a quantidade no início do ciclo. Assim, a quantidade de DNA que você precisa estudar aumenta exponencialmente. O facto de a PCR ser um processo de crescimento exponencial significa que os erros experimentais também crescerão exponencialmente, portanto, você precisa ter muito cuidado com o que faz com o processo.

“Várias pessoas decidiram que deveria ser possível estimar a quantidade de DNA presente em uma amostra usando PCR. Esta é a chamada PCR competitiva quantitativa. A ideia é adicionar à amostra a ser estimada uma quantidade conhecida de DNA semelhante, mas distinguível, e amplificar ambos juntos. A suposição é que as quantidades relativas dos dois produtos devem permanecer as mesmas e, portanto, você pode calcular o tamanho da amostra com a qual começou conhecendo a proporção dos dois, determinada pela observação quando a PCR produziu o suficiente de ambos para medir , e quanto DNA de controle foi adicionado.

“O que é absolutamente crucial é que as quantidades relativas do DNA de teste e seu controle conhecido devem permanecer exatamente iguais. Fechar não é bom o suficiente. As menores variações serão ampliadas exponencialmente e podem produzir grandes erros em sua estimativa.

“As dificuldades em usar PCR quantitativamente foram apontadas por Luc Raeymaekers na revista Analytical Biochemistry em 1993. Ele observou que artigos publicados sobre QC-PCR contêm dados que mostram que a suposição fundamental de que os tamanhos relativos das amostras permanecem constantes não é atendida em prática. Apesar disso, os pesquisadores do HIV continuam usando PCR para quantificar a carga viral. Simplesmente não há como saber se uma determinada estimativa está correta ou é 100.000 vezes mais alta!”

Todd Miller chama o QC-PCR de “a última moda da ciência” e concorda que, se as quantidades relativas de seu DNA de teste e seu controle conhecido não forem iguais, há uma coisa que você pode dizer com certeza sobre a estimativa de seu alvo inicial (a quantidade de RNA HIV proposto na amostra de sangue do paciente): Estará errado.

Como o QC-PCR, com todas as suas falhas, se tornou um teste de HIV aceitável? Miller explica:
“A forma como essa situação se manifestou na ciência moderna é assim: primeiro algumas pessoas passam muito tempo tentando fazer esse teste funcionar e, se tiverem sorte, acabam publicando artigos sobre ressalvas no procedimento . Em segundo lugar, outros recebem o teste para dar-lhes uma resposta que “faça sentido” e publicam seus dados como uma contribuição significativa para o campo. Terceiro, por causa de sua relativa novidade e natureza misteriosa, ele permanece quase aceito por muitos cépticos passivos e alguns utilizadores. No entanto, a maioria dos que o usam está mais interessada em seu próprio fenômeno de estimação do que na mecânica da reacção.”


PCR de DNA ramificado de bDNA
Este é o teste usado no artigo de Ho. Embora não seja, estritamente falando, PCR, é referido como tal, pois incorpora a tecnologia PCRtype. A diferença é que o bDNA amplifica o sinal, não o alvo. Ou seja, a PCR normal faz mais do alvo para que você possa encontrá-lo, enquanto o bDNA como que ilumina o alvo para que você possa vê-lo melhor. O Project Inform teve a gentileza de me enviar a seguinte explicação de como o bDNA funciona:9

“Cópias de uma sonda de DNA são fixadas na parede de um pequeno recipiente de laboratório; então a amostra é colocada. [Uma sonda de DNA é um pequeno pedaço de DNA complementar à sequência de DNA alvo.] Esta sonda se liga a uma certa parte do RNA do HIV, se for encontrado na amostra, mantendo o RNA no vaso . Em seguida, outra sonda de DNA é colocada; uma extremidade deste se liga a outra parte do RNA do HIV. A outra extremidade da segunda sonda tem muitas ramificações e cada ramificação termina com um químico “repórter” que, sob certas condições, produzirá luz, que pode ser detectada por equipamentos de laboratório. Cada molécula de RNA do HIV pode se ligar a uma dessas estruturas ramificadas e manter um pequeno número de fontes de luz, não apenas uma. Dessa forma, quantidades muito pequenas do RNA alvo podem ser detectadas, sem a necessidade de amplificação por PCR.”

Em seu artigo inicial, Ho não forneceu dados sobre os protocolos para este teste ou se era confiável. O leitor foi encaminhado para outros dois jornais que estavam “no prelo”. Portanto, nenhum dado estava disponível naquele momento para quem quisesse verificar esse método. Os dados obtidos do bDNA foram confirmados por QC-PCR, sendo os detalhes de QC-PCR apresentados em uma referência de autoria de quatro co-autores do estudo de Wei, dificilmente o que você poderia chamar de pesquisadores independentes ou objetivos. Na tradição da pesquisa do HIV, teorias não comprovadas e estudos falhos são aceitos sem questionamentos e incorporados à “sabedoria convencional” antes de serem devidamente validados. Até então, o dano está feito, e se as falhas subsequentes forem descobertas, isso pouco importa.

A mecânica do bDNA é complexa: estão ocorrendo cinco reacções de hibridização diferentes. A hibridização é uma técnica padrão em que uma sonda de DNA é colocada em uma amostra e se liga a quaisquer segmentos complementares que encontrar. É outro teste indirecto e tem muitos problemas. De acordo com o biólogo molecular Bryan Ellison, “A única vez que a biologia molecular funciona é se você purificar as coisas primeiro. Sempre há a possibilidade de reacções cruzadas, especialmente quando você coloca suas sondas em uma grande sopa de proteínas” (que é exatamente o que é a amostra de sangue alvo).

Duesberg apontou o seguinte: Depois de fazer os ajustes apropriados em seus cálculos, o próprio Ho descobriu mais tarde que mais de 10.000 vírus inferidos pelo ensaio de bDNA usado em seu artigo na Nature corresponderiam a menos de um vírus infeccioso, levando a se perguntar o que seria é que na verdade está sendo medido nesses testes.10 No entanto, esses artigos especulativos e não validados foram aceitos como verdade do evangelho! Na mente de Ellison, o estudo de Ho é “Pura fantasia. Nunca houve um artigo que mostrasse a carga viral.”


Os problemas com PCR
A PRECISÃO DA PCR NUNCA FOI VERIFICADA POR UM PADRÃO OURO ADEQUADO Para saber se algum teste diagnóstico para infecção pelo HIV realmente funciona, é necessário verificar o teste com um padrão ouro independente. O único padrão-ouro adequado para este propósito é o próprio HIV. Em outras palavras, os resultados do seu teste experimental, seja PCR ou qualquer outro, devem ser comparados aos resultados do isolamento do vírus em cada amostra testada. Se o vírus for realmente encontrado em cada paciente com PCR positivo e nenhum vírus for encontrado em cada paciente com PCR negativo, então você poderia dizer que o PCR é extremamente preciso para detectar o HIV.

O conceito de isolamento do vírus como padrão-ouro é particularmente importante no caso do HIV, uma vez que o HIV tem sido extremamente difícil, se não impossível, de definir em termos genéticos ou moleculares. Mesmo se alguém já tivesse realizado o isolamento de vírus para HIV11, ele nunca foi usado como padrão-ouro para qualquer teste de diagnóstico de HIV, incluindo PCR. Como está agora, o bDNA usa QC-PCR como padrão-ouro; QC-PCR usa PCR regular como padrão-ouro; A PCR regular usa testes de anticorpos como padrão-ouro e os testes de anticorpos usam uns aos outros. Tenho notado repetidamente que estudos que estão “verificando” um teste de anticorpos HIV invariavelmente afirmam que avaliaram o desempenho de seu teste em amostras que eram conhecidas como VERDADEIRO-POSITIVO ou VERDADEIRO-NEGATIVO. Como eles sabiam disso? É simples: sem um padrão-ouro, eles não o fizeram.

Às vezes, argumenta-se que “estudos mostraram” que esses testes concordam entre si ou confirmam as descobertas uns dos outros e, portanto, devem estar corretos. Isso não é um pensamento científico rigoroso. Às vezes você pode obter os resultados de diferentes testes para concordar uns com os outros, mas isso não prova nada – não mais do que provaria se cinco criminosos concordassem que estavam em outro lugar quando o banco estava sendo roubado. Eleopulos diz o seguinte sobre a importância dos padrões-ouro: “O uso do isolamento viral como meio independente de estabelecer a presença ou ausência do vírus é tecnicamente conhecido como padrão-ouro e é um elemento por excelência para a autenticação de qualquer teste diagnóstico. Sem um padrão-ouro, o investigador fica irremediavelmente desorientado, pois não tem um critério autônomo para avaliar o teste que pretende desenvolver. já encontrados na presença de infecção pelo HIV, ou seja, os testes são altamente específicos para a infecção pelo HIV.”

Até mesmo o conhecido pesquisador de AIDS William Blattner admitiu que “uma dificuldade em testar a especificidade e sensibilidade dos testes de retrovírus humanos (incluindo HIV) é a ausência de um ‘padrão-ouro’ final. Na ausência de padrões-ouro tanto para HTLV-1 quanto para HIV-1, a verdadeira sensibilidade e especificidade para a detecção de anticorpos virais permanecem imprecisas.” 12

Mark Craddock afirma que QC-PCR não foi verificado e provavelmente é não verificável. Ele pergunta: “Se a PCR é a única maneira pela qual o vírus pode ser detectado, então como você estabelece a carga viral precisa independentemente da PCR, para que você possa ter certeza de que os números fornecidos pela PCR estão corretos?” Tudo isso aparentemente foi perdido em pesquisadores de AIDS, pois é regularmente recomendado que PCR, particularmente QC-PCR, seja usado como padrão ouro para outros testes de HIV.9,13

A ESPECIFICIDADE DO PCR NUNCA FOI DETERMINADA
Especificidade significa a frequência com que um teste dará resultados negativos em pessoas não infectadas. A classificação de especificidade de um teste revela o nível de resultados falso-positivos esperados ao usar esse teste. Sem um padrão-ouro de isolamento de vírus, a verdadeira especificidade nunca será conhecida. Mesmo usando a concordância com testes de anticorpos como padrão-ouro, a PCR não se mostrou muito específica para HIV.6

Citando um estudo de proficiência envolvendo cinco laboratórios com extensa experiência em PCR, Sloand afirma que a especificidade média foi de 94,7%.14 A especificidade foi tão baixa como 90%. Os números nos anos 90 podem parecer bons, mas na realidade, não é esse o caso. O número de falsos positivos comparados aos verdadeiros positivos depende da prevalência da infecção pelo HIV em qualquer população testada15 – quanto menor a prevalência, mais falsos positivos. Sloand comenta que se os níveis de especificidade alcançados neste estudo fossem aplicados à população potencial de doadores de sangue” (os doadores de sangue agora consistem em membros da população geral de baixa prevalência), então “… os doadores seriam classificados como PCR positivo e 3.500 como PCR indeterminado. Assim, a PCR claramente não é adequada para triagem de rotina de sangue transfundido” e, por inferência, qualquer população de baixa prevalência. Com uma especificidade de 90%, eu diria que não era adequado para testar nenhuma população.

Em um fax que recebi dos Centros de Controle de Doenças (CDC) em 1994 sobre PCR, eles afirmaram que “nem sua especificidade nem sua sensibilidade são conhecidas” e que “a PCR não é recomendada e não é licenciada para fins de diagnóstico de rotina”. 16 Em poucas palavras, “A especificidade de qualquer forma de PCR, para o genoma do HIV, não foi determinada.”5

Os primers de PCR NÃO SÃO ESPECÍFICOS
De acordo com Eleopulos, Turner e Papadimitriou, “O requisito mínimo para [interpretar que um sinal de PCR positivo, ou hibridização em geral, prova a infecção pelo HIV] é a prova prévia de que os primers de PCR e as sondas de hibridização pertencem a um retrovírus único, HIV, e que as reacções de PCR e hibridização são específicas do HIV”. Turner me disse: “Os argumentos genômicos da PCR exigem o isolamento do HIV como absolutamente essencial. Caso contrário, como alguém sabe a origem do ácido nucleico?” Eleopulos contesta a realidade de um genoma de HIV distinto. Admitindo sua existência para fins de argumentação, ela oferece as seguintes evidências para demonstrar que a PCR não é específica para o HIV:17

Não há como ter certeza de que as sondas de ácido nucleico do “HIV” e os primers de PCR são específicos para o HIV porque: a maioria, se não todas, as sondas usadas para ensaios de hibridização, incluindo as sondas e primers de PCR, são obtidas de “HIV” cultivado em culturas de tecidos usando células (chamadas de linhagem celular) retiradas de um paciente com leucemia de células T4, uma doença que Gallo afirma ser causada por um retrovírus semelhante ao HIV – HTLV-I. E recentemente um retrovírus é reivindicado como tendo sido isolado de uma cultura de células não infectadas pelo HIV usando outra linhagem celular. Assim, as linhas de células padrão usadas para cultivar HIV mostraram indicar outros retrovírus. Uma vez que mesmo o método bem estabelecido para isolar retrovírus (que até hoje nunca foi feito para o HIV) não pode distinguir um retrovírus do outro, não se pode ter certeza de que as sondas de ácido nucleico do “HIV” e os primers de PCR sejam realmente específicos para o HIV.

Os genes propostos para o HIV hibridizam com os genes estruturais do HTLV-I e do HTLV-II, dois outros retrovírus humanos. Isso significa que, se as sondas encontrarem material genético desses outros retrovírus, elas se prenderão a ele e darão um sinal de que encontraram o HIV. Como é aceito que 10% dos pacientes com diagnóstico de AIDS são portadores do HTLV-I e que o genoma humano normal contém sequências relacionadas ao HTLV-I e HTLV-II, esse tipo de reação cruzada pode ser antecipado.

As células humanas normais contêm centenas ou milhares de sequências semelhantes a retrovírus, ou seja, pequenos trechos de DNA que correspondem a uma pequena parte do genoma proposto do HIV ou de outros retrovírus. E, como a PCR geralmente amplifica apenas uma pequena parte de todo o genoma do que está procurando, como você sabe que o que encontra não é uma sequência genética celular normal que coincide com parte do que é proposto para o HIV?

Outra evidência de que a PCR não é específica é que PCRs positivas podem ser obtidas de células sem ácidos nucleicos. Então, se não há ácido nucleico, não há DNA ou RNA, e se não há DNA ou RNA, certamente não há HIV.

Os produtos químicos usados ​​em laboratórios na preparação de culturas de tecidos (chamados de tampões e reagentes) podem dar sinais positivos de PCR para HIV.18


O PCR DETECTA APENAS UM PEQUENO FRAGMENTO DE UM VÍRUS INTEIRO
O PCR detecta, na melhor das hipóteses, genes únicos e, na maioria das vezes, apenas pedaços de genes. Se a PCR encontrar dois ou três fragmentos genéticos de uma possível dúzia de genes completos, isso não é prova de que todos os genes (o genoma inteiro) estejam presentes. Parte de um gene não é igual a uma partícula viral completa.
Especialistas em HIV admitem que a maioria dos genomas propostos para HIV estão incompletos; eles nunca poderiam orquestrar a síntese de uma partícula de vírus.
Turner explica: “Mesmo que todos os genomas estivessem completos, ter os planos não significa que você construiu a casa. Você pode carregar todo um genoma retroviral dentro de suas células por toda a vida sem nunca produzir uma partícula de vírus”. Esses dois problemas tornam ainda mais incerto qual é o significado de um PCR positivo.


O ENCONTRO DE “HIV RNA” NO PCR NÃO SIGNIFICA A PRESENÇA DE HIV
Hoje em dia, continua-se a ouvir a frase “HIV RNA PCR”. Qual é a diferença entre isso e o PCR de DNA antigo regular? A PCR regular procura a versão de DNA do que muitas vezes é aceite como o genoma do HIV; O RNA PCR procura a versão do RNA, ou seja, vírus livre que não infectou uma célula.

Com a nova noção de que o HIV estava se replicando aos bilhões, agora era necessário descobrir quanto vírus livre poderia haver em um determinado momento. O vírus livre conteria apenas RNA, portanto, se a PCR encontrar muito “RNA do HIV”, acredita-se que bilhões de cópias de vírus livres estejam fervilhando em torno dos tecidos do paciente. Em outras palavras, se você encontrar RNA, também encontrou HIV. Como se acredita que o HIV contém duas fitas de RNA, a fórmula sugerida é: Dois RNAs = um vírus.

Na realidade, as coisas não são tão simples. Em 1993, durante a fase “O HIV está escondido nos gânglios linfáticos” da teoria da carga viral, Piatak e colegas, incluindo Shaw, admitiram que, para determinar a quantidade de partículas de HIV, é preciso ter evidências prévias de que o RNA realmente pertence a uma partícula de HIV. 5 Nenhuma prova foi apresentada. Nenhuma relação ainda foi estabelecida entre a quantidade de RNA e a quantidade de partículas que podem ou não estar presentes. E ninguém estabeleceu se o RNA vem de uma partícula de vírus ou de outro lugar. Sem o isolamento do vírus, como você sabe a origem do ácido nucleico (RNA)?

VÍRUS SEM CÉLULAS NÃO É VÍRUS INFECCIOSO
Mesmo que Ho estivesse certo sobre bilhões de HIVs sem células estarem presentes na corrente sanguínea, o vírus livre por definição não é um vírus infeccioso; é irrelevante como um patógeno. Para o HIV infectar uma célula, sua proteína do envelope, gp120, deve se ligar ao local do receptor CD4 na superfície da célula. No entanto, já em 1983, Gallo apontou que “o envelope viral necessário para a infecciosidade é muito frágil. Ele tende a sair quando o vírus brota das células infectadas, tornando as partículas incapazes de infectar novas células”. Por causa disso, Gallo disse que “o contato célula a célula pode ser necessário” para a infecção retroviral. Como a gp120 é “crucial para a capacidade do HlV de infectar novas células”, e como a gp120 não é encontrada nas partículas livres de células, mesmo que grandes quantidades de HIV livre estejam presentes no sangue, elas não seriam infecciosas.17



A PCR NÃO É PADRONIZADO OU REPRODUTÍVEL
Em um artigo recente, Teo e Shaunak comentaram sobre a PCR in situ: “Apesar do esforço considerável, a técnica ainda é tecnicamente difícil e ainda não provou ser confiável ou reprodutível.”19 Em um estudo que comparou a PCR resultados dos testes de anticorpos, a PCR foi considerada não reprodutível e “Resultados falso-positivos e falso-negativos foram observados em todos os laboratórios (a concordância com os testes de anticorpos variou de 40% a 100%).“20



A PCR É SUSCETÍVEL À CONTAMINAÇÃO CRUZADA
Quantidades minúsculas de ácidos nucleicos de amostras anteriores podem facilmente contaminar a amostra atualmente sendo testada, dando um resultado falso-positivo.21 Mesmo pedaços microscópicos de pele ou cabelo do técnico de laboratório podem causar esse problema. Existem muitas fontes de contaminação cruzada, que pode ocorrer “em qualquer etapa do procedimento, desde o ponto de coleta das amostras até a amplificação final…”22 Outras causas de falso-positivos são enumeradas por Teo e Shaunak: “Já identificamos uma série de fatores que podem contribuir para a fraca amplificação do DNA alvo e para a geração de sinais falso-positivos. Esses fatores incluem os efeitos da fixação, abstração do reagente, degradação do DNA, marcação final do DNA e difusão do produto…. Acreditamos que uma cautela considerável deve ser exercida na interpretação dos resultados gerados usando PCR in situ.”19



FALSO-POSITIVOS OCORREM FREQUENTEMENTE COM PCR

Um estudo de proficiência para avaliar o desempenho da PCR do HIV na detecção de DNA livre de células mostrou “uma taxa perturbadoramente alta de positividade não específica” usando os primers comumente empregados (SK38/39, para o gene gag ou p24). De fato, taxas semelhantes de positividade foram encontradas para amostras negativas e positivas para anticorpos (18%versus 26%)!23

Das 30 crianças não infectadas, 6 tiveram resultados de PCR positivos “ocasionais”.24

O PCR realizado em crianças não infectadas com menos de um ano de idade mostrou que 9/113 (9 de 113), 15/143, 13/137, 7/87 e 1/63 crianças tiveram testes de PCR positivos.25

Entre 117 crianças não infectadas nascidas de mães infectadas pelo HIV, seis (5%) tiveram um PCR falso-positivo no sangue do cordão umbilical.26

Em um estudo de proficiência em PCR, 54% dos laboratórios envolvidos tiveram problemas com resultados falso-positivos; 9,3% do total de amostras não infectadas foram relatadas como positivas.22

Um dos 69 anticorpos negativos, não soroconversores foi PCR positivo.2

Um indivíduo de alto risco foi inicialmente PCR positivo, mas negativo em testes repetidos de PCR da mesma amostra por dois laboratórios diferentes.27

O grupo de trabalho de PCR da Organização Mundial da Saúde demonstrou altos níveis de resultados falso-positivos obtidos durante estudos de PCR de HIV “cegos”.22

Sheppard et ai. declarou em seu estudo: “Este estudo demonstrou que resultados falso-positivos, mesmo com algoritmos de teste rigorosos, ocorrem com frequência suficiente entre indivíduos não infectados para continuar sendo um problema sério.”28

Dos 327 profissionais de saúde expostos ao HIV por picada de agulha, 4 tiveram um ou mais resultados de PCR positivos e 7 tiveram resultados indeterminados. Amostras posteriores para todos os 11 foram negativas e nenhuma soroconverteu ou desenvolveu antigenemia p24, levando à conclusão de que “resultados falso-positivos ocorrem mesmo sob as condições de teste mais rigorosas.”29

Referências:

1. Embretson J, Zupancicl M, Ribas JL, et al. 1992. “Massive covert infection of helper T lymphocytes and macrophages by HIV during the incubation period of AIDS.” Nature. 362:359-362.

2. Pantaleo G, Graziosi C, Demarest J, et al. 1993. “HIV infection is active and progressive in lymphoid tissue during the clinically latent stage of disease.” Nature. 362:355-358.

3. Ho DD, Neumann AU, Perelson AS, et al. 1995. “Rapid turnover of plasma virions and CD4 lymphocytes in HIV-1 infection.” Nature. 373:123-126.

4. Wei X, Ghosh SK, Taylor ME, et al. 1995. “Viral dynamics in human immunodeficiency virus type 1 infection.” Nature. 373:117-122.

5. Eleopulos E, Turner VF, Papadimitriou J. 1995. “Turnover of HIV-1 and CD4 lymphocytes.” Reappraising AIDS. 3(6):2-4.

6. Eleopulos E, Turner VF, Papadimitriou J. Letter to Nature. 1994. “Is HIV really hiding in the Iymph nodes?”

7. Duesberg P, Bialy H. “Responding to ‘Duesberg and the new view of HIV”’ in AIDS: Virus- or DrugInduced. Kluwer Academic Publishers, Boston (1996).

8. Craddock M. 1995. “HIV: Science by Press Conference.” Reappraising AIDS. 3(5):-4.

9. Project Inform Fact Sheet: PCR Tests. August 1, 1995.

10. Duesberg P, Bialy H. 1995. “HIV an illusion.” Nature. 375:197.

11. Papadopulos-Eleopulos E, Turner VF and Papadimitriou JM. 1993. “Is a positive Western Blot proof of HIV infection?” Bio/Technology. 11:696-707.

12. Blattner WA. 1989. Retroviruses. pp545-592. In Viral Infections in Humans, third edition, edited by A Evans. Plenum Medical Book Company, New York.

13. Macy E, Adelman D. 1988. Letter to New England Journal of Medicine. December 15.

14. Sloand E, Pitt E, Chiarello R, et al. 1991. “HIV Testing: State of the art.” JAMA. 266:2861.

15. Maver, Robert. April 1993. “Testing AIDS Tests.” Rethinking AIDS. 1(4):4.

16. Centers for Disease Control Faxback document #320320, January 1993.

17. Eleopulos E, Turner VF, Papadimitriou J, Causer D. 1995. “Factor Vlll, HIV, and AIDS in hemophiliacs: An analysis of their relationship.” Genetica. 95(1-3):25-50.

18. Conway B. 1990. “Detection of HIV-1 by PCR in Clinical Specimens,” p40-45, in Techniques in HIV Research, edited by A Aldovini and BD Walker, MacMillan, New York.

19. Teo IA, Shaunak S. 1995. “PCR in situ: aspects which reduce amplification and generate falsepositive results.” Histochem. J. 27:660.

20. Defer C, Agut H, Garbarg-Chenon A, et al. 1992. “Multicentre quality control of polymerase chain reaction for detection of HIV DNA.” AIDS. 6:659.

21. Bootman JS, Kitchin PA. 1994. “Reference preparations in the standardization of HIV-1 PCR: An international collaborative study.” J. Vir. Meth. 49:1-8.

22. Bootman JS, Kitchin PA. 1992. “An international collaborative study to assess a set of reference reagents for HIV-1 PCR.” J. Vir. Meth. 37:23.

23. Busch MP, Henrard DR, Hewlett IK, et al. 1992. “Poor sensitivity, specificity, and reproducibility of detection of HIV-1 DNA in serum by polymerase chain reaction.” J. AIDS. 5:872.

24. Garbarg-Chenon A, Segondy M, Conge A, et al. 1993. “Virus isolation, polymerase chain reaction and in vitro antibody production for the diagnosis of pediatric human immunodeficiency virus infection.” J. Vir. Methods. 42:117.

25. Paui MO, Tetali S, Lesser ML, et al. 1996. “Laboratory diagnosis of infection status in infants perinatally exposed to human immunodeficiency virus type 1.” J. Inf. Dis. 173:68.

26. Simonon A, Lepage P, Karita E, et al. 1994. “An assessment of the timing of mother-to-child transmission of human immunodeficiency virus type 1 by means of polymerase chain reaction.” J. AIDS. 7:952.

27. Celum CL, Coombs RW, Lafferty W, et al. 1991. “Indeterminate human immunodeficiency virus type 1 Western Blots: Seroconversion risk, specificity of supplemental tests, and an algorithm for evaluation.” J. Inf. Dis. 164:656.

28. Sheppard HW, Ascher MS, Busch MP, et al. 1991. “A multicenter proficiency trial of gene amplification (PCR) for the detection of HIV-1.” J. AIDS. 4:277.

29. Gerberding JL. 1994. “Incidence and prevalence of human immunodeficiency virus, hepatitis B virus, hepatitis C virus, and cytomegalovirus among health care personnel at risk for blood exposure: Final report from a longitudinal study.” J. Inf. Dis. 170:1410. 


Versão traduzida, adaptada e reblogada – Original aqui






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